Isolando il clone
In generale, la clonazione viene eseguita al fine di ottenere il clone di un particolare gene o sequenza di DNA di interesse. Il prossimo passo dopo la clonazione, quindi, è trovare e isolare quel clone tra gli altri membri della libreria. Se la biblioteca comprende l'intero genoma di un organismo, allora da qualche parte all'interno di quella biblioteca sarà il clone desiderato. Esistono diversi modi per trovarlo, a seconda del gene specifico interessato. Più comunemente, viene utilizzato come sonda un segmento di DNA clonato che mostra l'omologia del gene ricercato. Ad esempio, se un gene del topo è già stato clonato, quel clone può essere usato per trovare il clone umano equivalente da una libreria genomica umana. Le colonie batteriche che costituiscono una biblioteca sono coltivate in una raccolta di capsule di Petri. Quindi una membrana porosa viene posata sulla superficie di ciascuna piastra e le cellule aderiscono alla membrana. Le cellule si rompono e il DNA è separato in singoli filamenti, tutti sulla membrana. La sonda è anche separata in singoli fili ed etichettata, spesso con fosforo radioattivo. Una soluzione della sonda radioattiva viene quindi utilizzata per bagnare la membrana. Il DNA della sonda a singolo filamento aderirà solo al DNA del clone che contiene il gene equivalente. La membrana viene essiccata e posizionata contro un foglio di pellicola sensibile alle radiazioni e da qualche parte sui film apparirà una macchia nera, che annuncia la presenza e la posizione del clone desiderato. Il clone può quindi essere recuperato dalle piastre Petri originali.
genetica: tecnologia del DNA ricombinante e reazione a catena della polimerasi
I progressi tecnici hanno svolto un ruolo importante nel progresso della comprensione genetica. Nel 1970 i microbiologi americani Daniel Nathans
Sequenziamento del DNA
Una volta clonato un segmento di DNA, è possibile determinarne la sequenza nucleotidica. La sequenza nucleotidica è il livello più fondamentale di conoscenza di un gene o genoma. È il progetto che contiene le istruzioni per la costruzione di un organismo e nessuna comprensione della funzione genetica o dell'evoluzione potrebbe essere completa senza ottenere queste informazioni.
usi
La conoscenza della sequenza di un segmento di DNA ha molti usi e ne seguono alcuni esempi. In primo luogo, può essere utilizzato per trovare geni, segmenti di DNA che codificano per una specifica proteina o fenotipo. Se una regione del DNA è stata sequenziata, può essere vagliata per le caratteristiche dei geni. Ad esempio, i frame di lettura aperti (ORF) - lunghe sequenze che iniziano con un codone iniziale (tre nucleotidi adiacenti; la sequenza di un codone determina la produzione di aminoacidi) e non sono interrotte da codoni di arresto (tranne uno alla loro fine) - suggeriscono un regione codificante per proteine. Inoltre, i geni umani sono generalmente adiacenti alle cosiddette isole CpG, gruppi di citosina e guanina, due dei nucleotidi che compongono il DNA. Se è noto che un gene con un fenotipo noto (come un gene della malattia nell'uomo) si trova nella regione cromosomica sequenziata, allora i geni non assegnati nella regione diventeranno candidati per quella funzione. In secondo luogo, è possibile confrontare sequenze di DNA omologhe di diversi organismi al fine di tracciare relazioni evolutive sia all'interno che tra le specie. Terzo, una sequenza genica può essere vagliata per regioni funzionali. Al fine di determinare la funzione di un gene, è possibile identificare vari domini comuni a proteine con funzioni simili. Ad esempio, alcune sequenze di aminoacidi all'interno di un gene si trovano sempre nelle proteine che abbracciano una membrana cellulare; tali tratti di aminoacidi sono chiamati domini transmembrana. Se si trova un dominio transmembrana in un gene di funzione sconosciuta, ciò suggerisce che la proteina codificata si trova nella membrana cellulare. Altri domini caratterizzano le proteine leganti il DNA. Numerosi database pubblici di sequenze di DNA sono disponibili per l'analisi da parte di qualsiasi individuo interessato.
